漆黃素抗卵巢癌的體內外作用討論

 
在婦科惡性腫瘤中卵巢惡性腫瘤發病率居第三位，其病死率居女性生殖系統腫瘤的首位。由于其早期起病隱匿，缺乏明顯臨床癥狀很難被及時發現和診斷，故約60%~70%的患者初診時已是中晚期。目前，國內外對于中晚期卵巢癌的臨床處理是行腫瘤細胞減滅術，術后輔以鉑類聯合紫杉類藥物的化學治療。但最終仍有超過70%的卵巢癌復發患者死亡。因此，目前對于卵巢癌的治療迫切需要尋找一種副作用少且有效的新型藥，以提高卵巢癌患者的生存率、生存質量等。漆黃素(3，3，4，7-四羥基黃酮)是黃酮類化合物的一種，屬于多酚類化合物，是從黃櫨等植物莖葉中提煉出來的食用性黃酮成分，廣泛存在于各種水果蔬菜中如蘋果草莓柿子、葡萄、洋蔥和黃瓜等。目前，國內外研究發現漆黃素在各類癌癥中表現出抗氧化、抗炎，抗細胞增殖，防腫瘤轉移，抗血管生成、抗過敏、抗血小板等多種作用。本實驗以不同濃度梯度的漆黃素作用卵巢癌細胞株，同時建立裸鼠卵巢癌移植瘤模型，觀察腫瘤細胞的增殖、凋亡和移植瘤的生長情況，旨在探索漆黃素對卵巢癌生長抑制、促凋亡的可能機制，為漆黃素應用于卵巢癌的治療提供理論依據。
 
1材料和方法
1.1實驗材料
漆黃素((純度98%)四川大學華西藥學院):人卵巢癌細胞株SKOV3(四川大學華西第二醫院婦科腫瘤生物治療實驗室):15只4~6周齡無胸腺雌性裸鼠(四川大學實驗動物中心);DMEM培養基、胎牛血清和胰酶(GibicoBRL公司);噻唑蘭(MTT，Sigma公司);流式細胞分析儀(Beckman Coulter公司)。日立H-6001V型透射電鏡(四川大學華西基礎醫學與法醫學院);酶標儀(美國BIORAD公司，型號680);倒置生物顯微鏡(重慶光電儀器有限公司型號XDS-1B);細胞培養箱(日本SANYO公司型號MCO-18M(UV));標準超凈化工作臺(美國AIRTECH公司型號SW-CJ-2FD)。
 
1.2實驗方法
1.2.1細胞培養
用含10%胎牛血清的DMEM培養基在37℃、體積分數5%Co2細胞培養箱中培養人卵巢癌細胞株SKOV3，細胞長滿培養瓶底70%~80%后，用胰酶消化、收集、離心、傳代。取對數生長期細胞用于實驗。
 
1.2.2透射電鏡(TEM)觀察卵巢癌細胞內的超微結構
在生長狀態良好的人卵巢癌細胞株SKOV3中加入漆黃素100mol/L作用細胞48h，然后將細胞用胰酶消化后收集于2mL離心管，2000r/min離心15min，棄去上清液。用吸管沿離心管壁緩慢加入0.5%戊二醛固定液2mL，在4℃環境中靜置10min。13000r/min離心10min，棄去上清液。沿離心管壁緩慢加人3%戊二醛固定液2mL固定。最后經1%四氧化鋨固定，丙酮逐級脫水，Epon812包埋，半薄切片光學定位，超薄切片，醋酸鈾及枸櫞酸鉛雙重染色。日立H-600IV型透射電鏡將細胞放大8000倍觀察。
 
12.3MTT法檢測卵巢癌細胞的增殖情況
將生長狀態良好的人卵巢癌細胞株SKOV3用胰酶消化后，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基將細胞配制成單細胞懸液，按每孔200L的體積接種于96孔板，細胞密度為每孔5103個。每組設6個復孔，同時設立只加培養基的空白組。在37℃、體積分數5%CO2孵箱中培養，孵育24h貼壁后，更換培養基，并分別以漆黃素不同濃度梯度(0(對照組)、25、50、100、200和400mol/L)進行干預?；旌戏跤?4~72h，待測孔內加入事先配制好的MTT溶液(5mg/mL)20L，在培養箱(37℃，體積分數5%CO2)中繼續培養4h，終止培養后，小心吸取孔內培養上清液，每孔再加入二甲基亞砜(DMSO)150L，避光室溫低速震蕩10min，使結晶顆粒充分溶解。最后選擇490nm波長，在酶聯免疫檢測儀上測定各孔吸光度(A)值，記錄結果，并計算細胞抑制率，抑制率(%)=(1-加藥組A值/對照組A組)100%。然后經改良寇式法計算50%生長抑制濃度(IC50)。
 
1.2.4流式細胞術檢測卵巢癌細胞的凋亡
當卵巢癌細胞鋪滿瓶底70%~80%時，予以25、50、100、200和400mol/L漆黃素處理48h。用不含EDTA的胰酶消化3min，離心(2000r/min，5min)收集。用含10%胎牛血清的PBS洗滌細胞2次(2000r/min，離心5min)，收集5105細胞，加入500LBindingBuffer懸浮細胞。然后加入5LAnnexinV-FITC混勻后，再加入5LPropidiumlodide(PI)混勻。室溫、避光、反應5~15min后，樣本通過流式細胞儀計數1.5104細胞進行分類分析。
 
1.2.5漆黃素對卵巢癌移植瘤的抑制作用
 
1.2.5.1試劑配制
將漆黃素溶解于聚乙二醇400(PEG400):DMSO=7:3的混合溶劑中，配制質量濃度80mg/mL，使用Millipore022m濾器過濾除菌，實驗前1h制備好
 
1.2.5.2實驗分組及處理
將生長狀態良好的人卵巢癌SKOV3細胞消化、收集、離心用PBS緩沖溶液重懸細胞后計數，調節細胞濃度為5107mL-1，以01mL注射于無胸腺雌性裸鼠的雙側背部皮下。將15只無胸腺雌性裸鼠隨機分為3組(n=5):
A組(對照組)，注射PEG400+DMSO;
B組，注射PEG400+DMSO+漆黃素(200mg/kg);
C組，注射PEG400+DMSO+漆黃素(400mg/kg)。
于注射人卵巢癌細胞SKOV3-周后開始漆黃素干預，漆黃素給藥方式為瘤體周圍皮下注射，每周連續給藥5d休息2d，每次注射藥物體積01mL，共持續2周。對照組注射相同體積的
PEG400+DMSO混合液，給藥方式相同。所有實驗步驟均遵守中國科學院上海實驗動物研究中心制定的實驗動物指南。
 
1.2.5.3移植瘤體積和質量的測量
裸鼠接種人卵巢癌SKOV3細胞后，從第1周周末開始，每周測量兩次腫瘤組織體積。3周后用Co2處死裸鼠，解剖并取下瘤體組織，測量離體腫瘤組織的體積[13]和質量，拍照記錄。取下的腫瘤組織消化并裂解細胞，用以檢測蛋白表達改變。
 
1.2.5.4Western blot 檢測
移植瘤中Bcl-2、Bax及聚腺苷二磷酸核糖多聚酶(PARP)蛋白的表達液氮條件下將移植瘤組織研磨成粉末，加入細胞裂解液(7mo/L尿素，2mol/L硫脲，40g/LCHAPS，65mmol/LDTT，體積分數0002Biolyte)并超聲室溫下靜置20min，然后在4℃下以13000r/min離心1h，取上液用蛋白定量分析試劑盒(Pierce BCA ProteinAssayKit)定量，余下樣品-70℃保存。次日用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，PVDF膜轉膜，經封閉、敷育抗體，洗膜，暗室顯色等步驟。
 
1.3統計學方法
百分率的比較用卡方檢驗;多組間的比較，先進行方差齊性檢驗，再進行單因素方差分析，組間兩兩比較采用Studentst檢驗。
P005為差異有統計學意義。
 
2結果
2.1漆黃素對SKOV3細胞超微結構的影響
100mol/L漆黃素處理人卵巢癌SKOV3細胞株48h后，電鏡下細胞超微結構。未處理的卵巢癌細胞具有較大的細胞核。經漆黃素處理后，在核膜下染色質形成界限清楚、均勻致密的團塊；核仁的改變包括核仁周圍散在的染色質凝結成異源性顆粒，位于核的中心；此時，胞漿的改變包括細胞骨架細絲的密集、核蛋白體顆粒成群，而在分泌細胞中，則有粗面內質網的再排列而形成同心圓狀；在胞膜下可見較多光面內質網形成的透亮空泡，并可與漿膜融合。
 
2.2細胞增殖抑制率結果
不同濃度梯度的漆黃素作用人卵巢癌細胞株SKOV324~72h，結果均顯示漆黃素對SKOV3細胞的生長呈現抑制作用。隨之漆黃素濃度的增大，即漆黃素對細胞的抑制作用呈濃度依懶性。漆黃素IC50值為132mol/L。隨漆黃素作用時間延長，同等濃度下細胞抑制率趨于穩定，3個時點間差異無統計學意義。
 
2.3細胞凋亡結果
在流式細胞術雙參數散點圖中，左上象限為壞死細胞，左下象限顯示活細胞，為AnnexinV-/PI-；右上象限是凋亡晚期細胞或凋亡繼發性壞死細胞，為AnnexinV+/PI+;而右下象限為早期凋亡細胞，為AnnexinV+/PI。流式細胞術AnnexinVIPI染色結果顯示，與對照組相比，各漆黃素濃度組細胞總凋亡率(早期凋亡率+晚期凋亡率)均升高(P均005)，且400mol/L濃度組mol/L濃度組mol/L濃度組(P005)。而漆黃素濃度25、50、100mol/L濃度組間的細胞凋亡率則無明顯變化(P0.05)。
 
2.4動物實驗結果
2.4.1裸鼠的基本情況
全部裸鼠在接種人卵巢癌細胞株SKOV3后，均在接種部位皮下出現約麥粒般大小的腫瘤；藥物干預期間裸鼠未出現死亡。
 
2.4.2移植瘤體積和質量的變化
結果顯示，藥物干預組隨著時間的延長，腫瘤體積與對照組的差異增大，高濃度(400mg/kg)漆黃素干預組腫瘤體積抑制最為明顯。裸鼠處死后，高濃度(400mg/kg)漆黃素干預組腫瘤的平均質量為(52524)mg，而低濃度(200mg/kg)漆黃素干預組腫瘤的平均質量為(87837)mg，均小于對照組【(108642)mg，P0.05】，并且高濃度(400mg/kg)漆黃素干預組腫瘤質量低于低濃度(200mg/kg)漆黃素干預組(P0.05)。
 
2.43移植瘤中Bcl-2、Bax等凋亡相關因子的表達
與對照組相比，經漆黃素治療后的裸鼠移植瘤組織中Bcl-2的表達有所降低，而Bax蛋白的表達有所升高，PARP蛋白出現明顯剪切，特別是高濃度(400mg/kg)漆黃素干預組變化較明顯。
 
3討論
手術輔以術后化療可使卵巢癌的復發率下降28%，死亡率下降34%。盡管如此，卵巢癌的治療結局依然不盡如人意，為提高卵巢癌尤其是中晚期卵巢癌患者的生存率及生存質量尋找有效、安全、無毒或低毒性的新型藥顯得尤為重要。黃酮類化合物廣泛存在干各種植物色素中，且被人類大量食用。目前，國內外研究發現漆黃素在各類癌癥中均表現出抗癌作用，漆黃素對結腸癌細胞的研究發現，其可通過抑制環氧化酶-2(COX-2)和Wnt/表皮生長因子受體/核因子-B(Wnt/EGFR/NF-B)信號通路，誘導細胞凋亡和抑制癌細胞的生長。漆黃素對前列腺癌的研究發現漆黃素呈時間-劑量依賴性的抑制細胞生長并抑制DNA合成同時，漆黃素通過調節線粒體凋亡通路誘導細胞凋亡。在一項對宮頸癌的研究中顯示漆黃素調控凋亡酶激活因子-1(Apaf-1)、細胞外信號調節激酶(ERK)和COX-2的分子機制來誘導宮頸癌HeLa細胞的凋亡及抑制細胞生長。漆黃素對人肺癌細胞株A549的研究發現，漆黃素可降低腫瘤細胞存活率和克隆形成率，增加人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白酶同源的基因(PTEN)表達，抑制哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)的表達。漆黃素在胰腺癌中抑制死亡受體(DR3)介導的NF-B活化，降低基質金屬蛋白酶9(MMP-9)表達，抑制細胞生長，誘導凋亡。漆黃素是否具有抗卵巢癌作用，國內外文獻報道均較少。本研究通過設計體內、體外兩部分實驗，應用現有成熟生物效應檢測技術，觀察漆黃素對卵巢癌細胞的作用，探究其作用機制，為尋找防治卵巢癌的有效低毒藥物及臨床探索提供有效的實驗依據。
腫瘤的發生主要是由于細胞增殖的調節失控，惡性腫瘤的發生及發展還與腫瘤細胞凋亡失控密切相關。目前，細胞凋亡對腫瘤治療作用的研究已成為腫瘤研究的熱點之一。本研究首先通過電鏡觀察漆黃素作用后的人卵巢癌細胞株SKOV3，發現細胞結構發生了凋亡的變化，進而選擇MTT實驗，證實漆黃素明顯抑制卵巢癌細胞的增殖，且增殖抑制作用呈濃度依賴性。這一結果與文獻報道的漆黃素對其它腫瘤的抑制作用結果相一致。研究表明漆黃素能誘導各種腫瘤細胞凋亡，從而發揮對腫瘤的抑制作用，本研究通過流式細胞術也證實漆黃素能夠誘導卵巢癌細胞的凋亡。本研究還建立了卵巢癌裸鼠移植瘤模型，探索漆黃素對裸鼠移植瘤的抑制作用。結果顯示，漆黃素干預組移植瘤的體積和質量均低于對照組，且高濃度(400mg/kg)漆黃素干預組較低濃度200mg/kg)組更明顯。這與漆黃素對前列腺癌移植瘤的抑制作用一致。此外，另有研究表明漆黃素在對卵巢癌的治療中是有效且安全的。
細胞凋亡是細胞的程序性死亡，它是由一類基因介導的細胞自主性死亡過程，表現為細胞膜完整，細胞體積變小，細胞核固縮，晚期可見凋亡小體。恢復和激發腫瘤細胞的凋亡能力并誘導細胞凋亡是腫瘤防治的有效方法。為進一步探討漆黃素誘導裸鼠卵巢癌細胞的凋亡作用，本研究檢測腫瘤組織中Bcl-2和Bax蛋白的表達水平，結果顯示，漆黃素干預組Bax蛋白表達高于對照，Bcl-2表達明顯低于對照組，且高濃度漆黃素干預組的表達水平變化更明顯。作為保護因子的Bc-2活性的降低和凋亡前蛋白Bax的激活使細胞更易損傷，從而促進細胞凋亡。而PARP被剪切則被認為是細胞凋亡的一個重要指標。動物實驗進一步證實了漆黃素作為潛在抗瘤藥物的有效性和可行性。這與近期的研究發現漆黃素對前列腺癌、結直腸癌、膀胱癌等各種腫瘤均有抗細胞增殖、誘導細胞凋亡的作用一致。
綜上本研究發現漆黃素在體內外均發揮了人對卵巢癌SKOV3細胞的抗腫瘤作用抑制了卵巢癌的發生發展，因此漆黃素有望成為一種預防和治療卵巢癌的安全有效的天然藥物。本課題組下一步擬擴大并細化檢測漆黃素在誘導卵巢癌細胞凋亡信號通路中各蛋白表達水平改變，增加體內實驗給藥方式如血管內、腹腔內給藥，探究藥物體內作用機制及其安全性評估，為準備開展漆黃素臨床藥理學實驗積累更多數據。